Proteinază K: caracteristici, activitate enzimatică și aplicații

Proteinaza K este o enzimă care aparține grupului serin proteazelor, adică are în centrul său catalitic activ o serină de aminoacizi și are funcția de a rupe legăturile peptidice prin hidroliză. Această enzimă, la rândul său, aparține familiei de proteine ​​subtilisin (peptidază S8).

Proteina K are o greutate moleculară (MW) de 28900 daltoni și a fost izolată pentru prima dată în 1974 din extracte ale albumului fungus Engyodontium, cunoscut anterior ca Tritirachium album Limber.

Prezintă o capacitate proteolitică ridicată, demonstrată pentru a putea degrada keratina prezentă în păr. Cuvantul keratin in engleza este scris "keratin", de aceea a fost numit "proteinaza K".

Datorită capacității sale mari de a ceda proteinele native, această enzimă este utilă în diferite tehnici de biologie moleculară. Se utilizează în principal pentru izolarea și prepararea acizilor nucleici cu greutate moleculară mare (MW).

Proteinaza K acționează prin eliberarea ADN-ului nuclear, în timp ce distruge proteinele și inactivează RNazele și DNasele, adică elimină nucleazele din preparatele ADN și ARN.

Pe de altă parte, s-a văzut că proteina K poate hidroliza unele proteine ​​native denaturate, ceea ce a trezit interesul cercetătorilor pentru utilizarea sa în studiul proteinelor prionice (PrP C).

Cu toate acestea, în ciuda potenței proteolitice ridicate, există proteine ​​care sunt rezistente la acțiunea proteinazei K. Printre acestea există unele proteine ​​anormale numite prioni (PrP Sc), asociate cu encefalopatiile spongiforme transmisibile.

Caracteristicile proteinazei K

Proteinaza K are o structură terțiară formată din trei straturi, cu o placă β de șapte lanțuri intercalate între două straturi de helici. Deoarece aparține familiei peptidelor S8, este caracterizată prin faptul că are o triadă catalitică în situsul său activ, a cărui ordine secvențială este (Asp, His și Ser), care le diferențiază de alte familii de peptidaze.

Această enzimă din grupul serin proteazelor se caracterizează prin hidroliza legăturilor peptidice apropiate de gruparea carboxilică a aminoacizilor alifatici și aromatici.

Pe de altă parte, este capabil să acționeze în prezența anumitor substanțe corozive, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu (SDS), Tris-HCL și EDTA, care sunt utilizate pentru a ajuta la denaturarea proteinelor, cauzând pierderea structurii lor native.

Acesta este un pas preliminar în pregătirea proteinelor pentru tehnica de electroforeză. Intervalul de pH la care acționează proteina K este destul de larg (2, 0 până la 12, 0), cu un pH optim între 7, 5 și 12, 0, iar punctul său izoelectric este de 8, 9. După cum se poate observa, acesta este activ împotriva unui domeniu foarte larg de pH.

O altă trăsătură care se evidențiază în proteina K este stabilitatea sa în prezența temperaturilor ridicate (50 - 60 ° C).

Activitatea enzimatică

Proteinaza K necesită prezența ionului de calciu, deși acest lucru nu afectează activitatea acestuia, dacă este esențial să se mențină stabilitatea acestuia.

Pentru ca proteina K să efectueze digestia completă a substratului, este necesar un timp de contact aproximativ între 5 minute și 2 ore.

Cu toate acestea, în acest sens, Daza și colab. Comparativ cu puritatea ADN-ului obținut la diferite momente de expunere la proteinază K și a concluzionat că o incubație prelungită (până la 24 ore) îmbunătățește semnificativ calitatea ADN-ului.

Acum, în ceea ce privește concentrația care este utilizată de enzima proteinază K în diferite protocoale, se poate spune că este foarte variată.

Poate fi utilizat din concentrații foarte scăzute (5 μg / ml) până la concentrații de 500 μg / ml. Dar cele mai frecvente concentrații de lucru variază între 50-100μg / ml, în special pentru digestia proteinelor și inactivarea nucleazelor. Deși pentru tratamentul țesutului este necesară o concentrație de 2 mg / ml.

aplicații

Aplicațiile sale sunt foarte largi și pot fi rezumate în următoarele:

- Se utilizează în digestia proteinelor și extracția ADN-ului prin câteva metode cum ar fi: salting-out, PK-SDS, bromură de cetil-trimetil amoniu (CTAB), acetat de potasiu modificat și extracție cu iodură de sodiu.

Inactivarea nucleazelor (RNazelor și DNazelor).

-In tehnica de hibridizare in situ (HIS), pentru a ajuta la eliberarea de acid nucleic, în plus față de eliminarea proteinelor nedorite.

Modificarea proteinelor.

- La nivel de cercetare, în diferite studii.

Avantajele proteinazei K

S-au efectuat mai multe studii comparative între tehnicile de extracție a ADN-ului utilizând Proteinaza K, cu alții care nu o utilizează și toți au concluzionat că există beneficii mai mari atunci când se utilizează enzima. Printre avantaje se pot menționa următoarele:

- se obține ADN cu greutate moleculară ridicată, calitate înaltă și puritate.

ADN-ul extras este stabil pentru o perioadă de până la 3 luni.

ADN-ul extras poate fi utilizat în următoarele tehnici: Southern blot, reacția în lanț a polimerazei (PCR), electroforeza, printre altele.

Proteine ​​rezistente la proteinază K

Mai multe cercetări au concluzionat că prioni (proteine ​​toxice PrPSc anormale) sunt diferențiate de proteinele PrPC (native) deoarece sunt rezistente la acțiunea proteinazei K, în timp ce PrPC sunt sensibile la acțiunea lor.

Alți autori au descris că în structura PrPSc există porțiuni sensibile și altele rezistente la proteinază K. Cu toate acestea, ambele părți sunt la fel de toxice și infecțioase.

Pe de altă parte, Bastian și colaboratorii în 1987 au izolat 4 proteine ​​de 28, 30, 66 și 76 kda de la o specie de Spiroplasma mirum . Toți au fost rezistenți la acțiunea proteinazei K și, de asemenea, au reacționat încrucișat cu unele prioni.

Se știe că această specie poate provoca cataractă și daune neurologice importante și datorită descoperirilor științifice ale lui Bastian, printre alte investigații, sa încercat să se raporteze acest microorganism la encefalopatiile spongiforme transmisibile.

Cu toate acestea, etiologia acestei patologii neurologice degenerative este încă atribuită prionilor.

În acest sens, Butler și colaboratorii din 1991 au identificat și au caracterizat o clasă de proteine ​​rezistente la proteina 40 Kda din două tulpini de Mycoplasma hyorhinis. Acest agent patogen afectează porcii, infectând țesuturile lor, dar în acest caz nu a existat o reacție încrucișată cu prionii testați.

Sunt necesare mai multe cercetări pentru a elucida multe necunoscute despre acest lucru.